5.1 Návrh genově specifických PCR primerů pro diagnostiku
Prostřednictvím
Primer3 navrhněte pár primerů pro detekci ORF1 ze sekvence uložené v
GenBank
pod přístupovým kódem AJ132803. Nejprve určete procentuální obsah GC párů v analyzované sekvenci pomocí
SMS2.
Podle zjištěného obsahu lze případně upravit %GC pro požadované primery v případě, že není dosaženo uspokojivého výsledku. Délku primeru ponechejte na výchozím nastavení. Ověřte, že navržený pár primerů je uvnitř požadovaného ORF1 v sekvenci. Nejlepší pár primerů dále analyzujte
OligoAnalyser nebo
FastPCR a stanovte jejich parametry.
5.1.1 Jaký obsah GC párů má analyzovaná sekvence?
Odpověď:
34%
5.1.2 Jak dlouhý bude produkt amplifikovaný vámi navrženými primery?
Odpověď:
158 bp nebo 247 bp
5.1.3 Jaká je optimální teplota pro annealing pro navrženou reakci?
Odpověď:
54-55 °C
5.1.4 Vytváří některý z primerů stabilní vlásenku s deltaG nižší než -1 kcal/mol nebo homo- a heteroduplexy s deltaG nižší než -5 kcal/mol?
Odpověď:
Ne
5.2 Návrh primerů pro PCR pomocí NCBI Primer-BLAST
Otevřeze záznam sekvence v GenBank s přístupovým kódem
AJ132803
a proveďte
návrh primerů pro amplifikace části této sekvence prostřednictvím
NCBI Primer-BLAST přes odkaz "
Pick Primers".
5.2.1 Analyzujte dvojice primerů, které specificky detekují všech 50 kompletních genomů Staphylococcus aureus
5.2.2 Kolik párů primerů cílí pouze do ORF2 z uvedené sekvence?
Odpověď:
7
5.2.3 Můžete pozorovat u některého z cílových míst pro navržené primery jednonukleotidové polymorfismy?
Odpověď:
Ne, pouze u dvou primerů cílících do ORF1
5.3 Návrh oligonukleotidů pro sekvenování
Ve vhodné vzdálenosti od každého z konců sekvence "
Sample3" navrhněte
primer pro sekvenování – procházení primerem, tak
abychom získali další pokrytí nespolehlivě stanovených zbytků označených N a současně bylo možné stanovit sousedící neznámou sekvenci.
Pro návrh primerů použijte aplikaci
Primer3.
>Sample3
TNTTAGNGTNCNCATNCACTNTTGGNGCCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGNGG
TCGACGGTATNCGATAAGCTTTCTTTACAGAATTTGCTATTTTCATGGGACGTGGAG
GCGGGAAAAACGGTCTAATAAGTGCTATTAGTGATTTTCTTTCTACGCCCTTACACG
GAGTTAAAGAATATCACATCTCCATTGTTGCTAATAGTGAAGATCAAGCAAAAACAT
CGTTTGATGAAATCAGAACCGTTTTAATGGATAACAAACGAAATAAGACGGGTAAAA
CGCCAAAAGCTCCTTATGAAGTTAGTAAAGCAAAAATAATAAACCGTGCAACTAAAT
CGGTTATTCGATATAACACATCAAACACAAAAACCAAAGACGGTGGACGTGAGGGGT
GTGTTATTTTTGATGAAATTCATTATTTCTTTGGTCCTGAAATGGTAAACGTCAAAC
GTGGTGGATTAGGTAAAAAGAAAAATAGAAGAACGTTTTATATAAGTACTGATGGTT
TTGTTAGAAAGGGTTATATCGATGCAATGAAGCACAAAATTGCAAGTGTATTAAGTG
GCAAGGGTAAAAATAGTAGATGGGTTGCTTTTTATTGGNAAGTTAGACNATCCAAAA
GAAGTTGATGACGGACAGACNTGGGAAANGCGAACCCATGGTCCTTAAACCGTNTCA
GAATCCCTAAACCTGGTAACNCNATTGAAGAANAATTTAC
5.3.1 Jak daleko od posledního neidentifikovaného zbytku "N" jsou primery navržené s výchozím nastavením programu?
Odpověď:
Levý primer 205 nt, pravý primer 147 nt
5.4 Návrh primerů s modifikovanými konci pro klonování PCR produktu
Pro amplifikaci části
sekvence o délce 150 – 250 bp uložené v
GenBank
pod přístupovýcm kódem
EU888127 navrhněte
dvojici primerů s modifikovanými 5‘-konci tak,
aby nesly restrikční místa a bylo možné produkt PCR klonovat do vektoru.
Pro návrh primerů použijte aplikaci
Primer3
a níže
uvedené instrukce.
Prostřednictvím aplikace
OligoAnalyser nebo
FastPCR
otestujte u navržených primerů
tvorbu dimerů.
• délka primerů bude
24-28 bp
• první primer bude obsahovat na 5‘-konci restrikční místo
NdeI
(sekvence restrikčních míst najdete v databázi
REBASE);
efektivní štěpení restriktázou vyžaduje navíc přítomnost
7 bází na 5‘-konci;
restrikční místo NdeI obsahuje iniciační
kodon ATG, připojte ho k primeru tak,
abyste zachovali
otevřený čtecí rámec.
• druhý primer bude obsahovat na 5‘-konci restrikční místo
BamHI (sekvence restrikčních míst najdete v databázi
REBASE);
efektivní štěpení vyžaduje navíc přítomnost
2 bází na 5‘-konci.
• primery by neměly vytvářet stabilní dimery (navzájem ani samy se sebou)
Řešení: