Návrh sekvencí primerů

5.1 Návrh genově specifických PCR primerů pro diagnostiku
Prostřednictvím Primer3 navrhněte pár primerů pro detekci ORF1 ze sekvence uložené v GenBank pod přístupovým kódem AJ132803. Nejprve určete procentuální obsah GC párů v analyzované sekvenci pomocí SMS2. Podle zjištěného obsahu lze případně upravit %GC pro požadované primery v případě, že není dosaženo uspokojivého výsledku. Délku primeru ponechejte na výchozím nastavení. Ověřte, že navržený pár primerů je uvnitř požadovaného ORF1 v sekvenci. Nejlepší pár primerů dále analyzujte OligoAnalyser nebo FastPCR a stanovte jejich parametry.
5.1.1 Jaký obsah GC párů má analyzovaná sekvence? Odpověď: 34%
5.1.2 Jak dlouhý bude produkt amplifikovaný vámi navrženými primery? Odpověď: 158 bp nebo 247 bp
5.1.3 Jaká je optimální teplota pro annealing pro navrženou reakci? Odpověď: 54-55 °C
5.1.4 Vytváří některý z primerů stabilní vlásenku s deltaG nižší než -1 kcal/mol nebo homo- a heteroduplexy s deltaG nižší než -5 kcal/mol? Odpověď: Ne
5.2 Návrh primerů pro PCR pomocí NCBI Primer-BLAST
Otevřeze záznam sekvence v GenBank s přístupovým kódem AJ132803 a proveďte návrh primerů pro amplifikace části této sekvence prostřednictvím NCBI Primer-BLAST přes odkaz "Pick Primers".
5.2.1 Analyzujte dvojice primerů, které specificky detekují všech 50 kompletních genomů Staphylococcus aureus
5.2.2 Kolik párů primerů cílí pouze do ORF2 z uvedené sekvence? Odpověď: 7
5.2.3 Můžete pozorovat u některého z cílových míst pro navržené primery jednonukleotidové polymorfismy? Odpověď: Ne, pouze u dvou primerů cílících do ORF1
5.3 Návrh oligonukleotidů pro sekvenování
Ve vhodné vzdálenosti od každého z konců sekvence "Sample3" navrhněte primer pro sekvenování – procházení primerem, tak abychom získali další pokrytí nespolehlivě stanovených zbytků označených N a současně bylo možné stanovit sousedící neznámou sekvenci. Pro návrh primerů použijte aplikaci Primer3.

>Sample3
TNTTAGNGTNCNCATNCACTNTTGGNGCCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGNGG
TCGACGGTATNCGATAAGCTTTCTTTACAGAATTTGCTATTTTCATGGGACGTGGAG
GCGGGAAAAACGGTCTAATAAGTGCTATTAGTGATTTTCTTTCTACGCCCTTACACG
GAGTTAAAGAATATCACATCTCCATTGTTGCTAATAGTGAAGATCAAGCAAAAACAT
CGTTTGATGAAATCAGAACCGTTTTAATGGATAACAAACGAAATAAGACGGGTAAAA
CGCCAAAAGCTCCTTATGAAGTTAGTAAAGCAAAAATAATAAACCGTGCAACTAAAT
CGGTTATTCGATATAACACATCAAACACAAAAACCAAAGACGGTGGACGTGAGGGGT
GTGTTATTTTTGATGAAATTCATTATTTCTTTGGTCCTGAAATGGTAAACGTCAAAC
GTGGTGGATTAGGTAAAAAGAAAAATAGAAGAACGTTTTATATAAGTACTGATGGTT
TTGTTAGAAAGGGTTATATCGATGCAATGAAGCACAAAATTGCAAGTGTATTAAGTG
GCAAGGGTAAAAATAGTAGATGGGTTGCTTTTTATTGGNAAGTTAGACNATCCAAAA
GAAGTTGATGACGGACAGACNTGGGAAANGCGAACCCATGGTCCTTAAACCGTNTCA
GAATCCCTAAACCTGGTAACNCNATTGAAGAANAATTTAC

5.3.1 Jak daleko od posledního neidentifikovaného zbytku "N" jsou primery navržené s výchozím nastavením programu? Odpověď: Levý primer 205 nt, pravý primer 147 nt
5.4 Návrh primerů s modifikovanými konci pro klonování PCR produktu
Pro amplifikaci části sekvence o délce 150 – 250 bp uložené v GenBank pod přístupovýcm kódem EU888127 navrhněte dvojici primerů s modifikovanými 5‘-konci tak, aby nesly restrikční místa a bylo možné produkt PCR klonovat do vektoru. Pro návrh primerů použijte aplikaci Primer3 a níže uvedené instrukce.
Prostřednictvím aplikace OligoAnalyser nebo FastPCR otestujte u navržených primerů tvorbu dimerů.
• délka primerů bude 24-28 bp
• první primer bude obsahovat na 5‘-konci restrikční místo NdeI (sekvence restrikčních míst najdete v databázi REBASE); efektivní štěpení restriktázou vyžaduje navíc přítomnost 7 bází na 5‘-konci; restrikční místo NdeI obsahuje iniciační kodon ATG, připojte ho k primeru tak, abyste zachovali otevřený čtecí rámec.
• druhý primer bude obsahovat na 5‘-konci restrikční místo BamHI (sekvence restrikčních míst najdete v databázi REBASE); efektivní štěpení vyžaduje navíc přítomnost 2 bází na 5‘-konci.
• primery by neměly vytvářet stabilní dimery (navzájem ani samy se sebou)

Řešení:



MENDELOVO CENTRUM pro vzdělávání v biologii, biomedicíně a bioinformatice CZ.1.07/2.5.00/09.0186

Aktuální cvičení:


Další informace:
Cvičení
Nukl. kyseliny
Proteiny
Struktury
Nástroje
Ke stažení
Bioinformatika - proteiny
Bioinformatika - nukl. kyseliny
Bioinformatické databáze
Manipulace se sekvenčními daty
Párové sekvenční přiložení
Mnohonásobné sekvenční přiložení
Návrh primerů
Hledání a identifikace genů
Analýza proteinových sekvencí
NGS data a lokální anotace
Strukturní databáze
Předpověď struktury proteinů
GenBank
EMBL-Bank
DDBJ
dbEST
UniGene
UniProtKB
NRDB
PIR
PROSITE
Pfam
INTERPRO
PDB
MMDB
PDBsum
CATH
SCOP
BLAST
FASTA
LALIGN
ClustalW
T-Coffee
MUSCLE
PSIPRED
JPRED
PHD
PuTTY
WinSCP
SPdbV
PyMOL
RasMol
BioEdit
MEGA3
TreeView